DNA 6mA 甲基化测序服务

DNA 6mA 甲基化测序 | 基因活性调控研究

DNA甲基化是最基本的表观修饰方式。在真核生物中，最常见的甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶胞嘧啶（5mC）。相反地，在原核生物中，N6-甲基腺嘌呤（6mA,或m6A）是最普遍的DNA修饰，即腺嘌呤环第6位添加了一个甲基。目前研究最多的是原核生物DNA的6mA。起初发现6mA在细菌中作为一种限制-修饰系统（RM:restriction-modification system），其限制性内切酶能将外源DNA切断。每种内切酶在DNA上都有一定的结合位点。当菌株自身的DNA也含有这样的结合位点时，则该菌株的甲基化酶就在这些识别位点上将腺嘌呤甲基化，这样，限制性内切酶就不会将自身的DNA降解掉。两方面结合起来，称为限制-修饰系统。后来发现原核生物中的6mA在DNA 错配修复，染色体复制，细胞防御，细胞周期调控，转录等扮演了重要的角色。2012年的一篇 nature biotechnology文章中2，采用三代测序平台Pacbio对大肠杆菌的6mA进行了全基因组层面的筛选，鉴定出近5万个6mA位点，并且拓宽了人们对RM系统的新认知。

技术优势

一站式服务：
客户只需提供相关样品的基因组DNA，从6mA-IP富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程
优化的实验流程：
6mA-IP的富集效率是决定数据质量的关键，6mA-IP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性
严格的质控：
实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程保证实验质量，确保客户得到优质的数据
专业的生物信息学分析：
具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求

科学方案设计

DNA 6mA特征分布
6mA分布motif
DNA 6mA形成与去除
6mA动态变化
6mA功能
核小体的定位

实验流程

目前所能看到的方法大概有4种。主要是：（1）基于免疫沉淀法；（2）限制酶切法；（3）LC-MS/MS法和（4）三代单分子测序法，包括Pacbio平台和Oxford Nanopore平台测序法。

免疫沉淀法

免疫沉淀法大致有两种：6mA-IP和6mA-CLIP-exo。6mA-IP的方法和MeDIP差不多。先是把gDNA打断成200-400bp长度范围的小片段，然后修复末端，加A碱基，加接头；接着变性成单链DNA；然后用合适的6mA的抗体（比如SYSY 6mA抗体，或者Abcam抗体等）做免疫沉淀吸附，富集包含6mA的DNA 片段；最后用来构建文库，上机测序。测序的片段mapping回参考基因组，这个时候，出现高深度reads覆盖的区域就包含了6mA位点（参考Figure 3左上角的深度峰图）。 6mA-IP方法的优势是可以对低丰度的6mA做到放大富集，但是有的抗体并不能很好的区分1mA和6mA，而且6mA-IP的分辨率很低，大约在200bp左右。 6mA-CLIP-exo是另外一种分辨率更高的免疫沉淀方法。在gDNA打断后，先用识别6mA的抗体进行孵育；再用254nm的紫外线进行交联和抗原抗体免疫沉淀；然后末端修复，加接头；接下来用外切酶从gDNA片段的5端切割，到6mA位点结束（抗体在这里既起到钓出包含6mA的序列，又起到保护6mA碱基不被酶切的作用）。然后用蛋白酶消化掉抗体，变性，合成第二条链；加第二个接头；最后PCR扩增放大，构建文库，上机测序。6mA-CLIP-exo的分辨率可以达到33bp左右。

免疫沉淀法

限制酶切法的原理是基于某些酶对甲基化位点比较敏感，比如DpnI可以切割5’-G6mATC-3’位点，而DpnII只能切割未甲基化的5’-GATC-3’位点。那么DpnII酶就有作为6mA检测的潜力。 6mA-RE-qPCR方法如Figure 5所示，采用两组对照实验，第一组不用酶切，而第二组用CviAII或者DpnII甲基化敏感酶做酶切实验。这个时候，两组的底物gDNA就出现了差别，前者是所有的目标区都存在，而后者会把非6mA甲基化位点都切断（当然这只是理想状态，事实上酶切实验很难做到这种状态，存在酶切不完整的情形）。后者未切割的片段代表6mA甲基化的部分。然后做qPCR定量分析，6mA的比例通过酶切后的PCR产物/未酶切的PCR产物来表示。

6mA-RE-seq方法图示

SMRT检测6mA甲基化原理图示

Nanopore测序技术具有检测DNA甲基化潜力

三代单分子测序法

目前已经有多个单分子实时测序技术（SMRT：single molecule real-time sequencing）用来做DNA 6mA检测的成功案例。SMRT测序时，特定单碱基的添加结合时间可以被实时检测到。如果一个碱基被甲基化了，或者同一个碱基类型在不同的部位被甲基化（如4mC和5mC;1mA和6mA），会表现出不同的动力学差异（KV: kinetic viariation），具体体现为脉冲时长的差异。据此可以检测出碱基的甲基化信息。甲基化的A脉冲间隔时间是非甲基化A的5倍以上。SMRT方法具有高效、单碱基分辨率的优势。其缺陷是不能很好的区分6mA和1mA，需要和LC-MS/MS等方法结合确定两种甲基化的相对丰度。另外SMRT需要高深度的数据来检测甲基化。

测序工作流程

1

制备您的文库
2

高效测序
3

分析和存储数据

我们的优势

拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，实验周期短，质量可靠。

拥有Illumina HiSeq 2500、MiSeq等多种高通量测序平台。

技术人员经验丰富，可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。

拥有专业的生物信息团队和超算服务器，可为合作伙伴提供全面生物信息分析服务与技术支持。

illumina 二代测序平台
PacBio单分子三代测序仪
nanopore纳米孔测序仪
Bionano单分子测序平台-Lrys系统

高性能节点服务器 | 分析无忧

基于Dell，超威等国际知名服务器供应商的支持，运用高性能刀片节点高密度计算性能，总计提供20000+核心算力，保证24x7连续生产力安全稳定。

Nvme SSD硬盘 | 让分析速度飞起来

基于Nvme SSD固态硬盘加速器，可以淋漓尽致发挥出网络计算的魅力，让你的任务计算飞起来！

高通量 | 高速率 | 无阻塞网络集群

高通量测序数据日益加大，呈指数型积累上升，必须交由高速网络提速分析。

基于以色列Infiniband技术，惠研云构建优化了集群计算性能，使得计算IO提升300%，持续数据交互速率提高到2T总带宽，保证集群中任务与数据0延迟，无阻塞。

沪ICP备13027963号